原代细胞永生化4种主流方法对比：hTERT、SV40、HPV E6/E7、EBV详解
原代细胞更接近体内真实状态，是疾病机制、药物筛选和功能验证的重要研究工具。但随着传代次数增加，细胞常会出现增殖减慢、衰老甚至停止分裂。为了延长其体外培养寿命，研究者通常会进行细胞永生化。其中，hTERT、SV40HPV、E6/E7和EBV是几种常见方案。它们有何区别，又该如何选择？
| hTERT：更注重保留原代细胞特征
正常体细胞每分裂一次，染色体末端的端粒通常都会缩短。当端粒缩短到一定程度后，细胞会启动DNA损伤反应，进入衰老或停止分裂。hTERT是人端粒酶逆转录酶的催化亚基。外源表达hTERT后，端粒酶活性增强，可在染色体末端补充端粒重复序列，从而延缓端粒耗竭，使细胞获得更长的增殖寿命。
该方法通常采用质粒转染、慢病毒或逆转录病毒转导等方式，将hTERT基因稳定导入原代细胞；随后通过抗性筛选或荧光分选富集阳性细胞，再进行扩增和连续传代观察。
相比病毒癌基因介导的永生化，hTERT对p53、Rb等细胞周期调控通路的直接干扰通常较少，因此更有利于保留原代细胞的形态和部分生物学特征，适用于对生理相关性要求较高的研究。不过，部分细胞的衰老并非仅由端粒缩短引起，单独导入hTERT未必能够实现稳定永生化，可能还需结合其他调控策略。
图1 端粒酶延长染色体末端的基本机制
图源：David O. Morgan，经Wikimedia Commons获取
| SV40：永生化效率较高，适用范围较广
SV40永生化通常利用其大T抗原，而不是依靠完整病毒持续感染。SV40大T抗原可与p53和Rb家族蛋白结合，削弱细胞周期检查点。其中，Rb受抑制后可释放E2F转录因子，推动细胞由G1期进入S期；p53相关应答受到影响后，细胞也更容易绕过衰老或凋亡。部分构建方案还会使用SV40小t抗原，进一步调节与增殖有关的信号通路。
该方法一般通过质粒、慢病毒或逆转录病毒载体，将SV40大T抗原基因稳定导入原代细胞。完成筛选后，对阳性细胞进行扩大培养，建立混合细胞群或单克隆细胞株。
这类方法通常效率较高、起效较快，常用于较难通过hTERT单独实现永生化的细胞。但由于其对关键细胞周期通路影响较明显，也可能改变细胞的增殖特征、基因表达或功能表型。因此，建系后需要开展形态、标志物及相关功能验证。
图2 SV40 LT抗原通过干预Rb–E2F和p53通路促进细胞持续增殖
图源：Xu H. et al., Microorganisms, 2023，CC BY 4.0
| HPV E6/E7：适合部分上皮细胞研究
HPV E6/E7永生化通常使用高危型HPV来源的E6和E7基因。E6可与宿主蛋白E6AP形成复合物，促进p53降解或削弱其功能；E7则可结合并抑制Rb蛋白，使E2F释放，推动细胞进入DNA复制阶段。二者协同作用，使细胞绕过衰老检查点并持续增殖。因此，E6和E7一般联合使用，而不是只导入其中一种。
该方法通常利用慢病毒、逆转录病毒或质粒载体，将E6/E7基因导入细胞，再通过抗性筛选、荧光分选或克隆化获得稳定表达细胞。该方法在角质形成细胞、宫颈上皮细胞、口腔上皮细胞等上皮来源细胞中较常见。
HPV E6/E7具有较强的促增殖作用，但同样可能对细胞周期和相关信号通路产生影响。如果研究内容涉及肿瘤发生、病毒感染、p53或Rb通路，选择时尤其需要谨慎，避免永生化方式成为实验结果的干扰因素。
图3 HPV E6介导p53降解、E7抑制pRb并释放E2F的作用机制
图源：Pal A. & Kundu R., Front. Microbiol., 2020，CC BY
| EBV：主要用于B淋巴细胞永生化
EBV感染B细胞后，病毒基因组通常以附加体形式存在于细胞核内，并表达多种潜伏期蛋白。其中，EBNA2等蛋白可调控宿主及病毒相关基因表达；LMP1可模拟CD40信号，激活NF-κB、JAK/STAT等增殖与存活通路；LMP2则可模拟部分B细胞受体信号。多种病毒蛋白共同作用，使B细胞绕过正常增殖限制，获得持续分裂能力。
该方法通常从外周血中分离PBMC或富集B细胞，再使用含EBV的病毒液进行感染。培养过程中可采用适当方法抑制T细胞对EBV感染B细胞的清除。感染成功后，细胞逐渐增大并形成典型的成团生长，随后通过持续培养和扩增建立稳定的LCL。
EBV永生化常用于人类遗传学、免疫学、药物研究以及珍贵临床样本的细胞资源保存。其优势是对B细胞转化效率较高，并可在一定程度上保留供者遗传背景。
图4 EBV潜伏期基因产物协同促进B细胞永生化
图源：Xu H. et al., Microorganisms, 2023，CC BY 4.0
海星生物根据细胞来源及生物学特性选择差异化永生化方案。目前产品中，多数永生化原代细胞采用慢病毒介导的SV40基因导入（如永生化人牙龈成纤维细胞、永生化人心脏微血管内皮细胞、永生化小鼠心肌成纤维细胞等）；
部分间充质干细胞采用SV40与hTERT联合方案（如永生化成人脂肪间充质干细胞、永生化SD大鼠骨髓间充质干细胞、永生化SD大鼠脂肪间充质干细胞等）；
B淋巴细胞则可通过EBV转化建立B-LCL，海星生物可提供B细胞永生化技术服务。
海星生物提供多种永生化原代细胞及定制建系服务，从细胞来源、身份确认到培养质量进行规范管理。产品提供STR溯源信息，帮助研究者核验细胞身份，减少误用及交叉污染风险；同时经过支原体检测，结果为阴性，降低支原体污染对细胞状态和实验数据的影响。部分产品还提供免疫荧光鉴定等质量资料，并经过连续传代能力验证。搭配适配培养体系及技术支持，可减少研究者前期分离、建系和条件摸索的投入，为机制研究、药物筛选及长期重复实验提供稳定、可靠的细胞工具。具体检测项目及产品资料请以对应批次质检报告为准。