周细胞是微血管壁的“多面手”，在维持血脑屏障、调控血管生成及组织稳态中扮演着不可或缺的角色。从神经退行性疾病的机制探索，到血管化类器官与3D生物打印的构建，高质量的原代周细胞都是关键的研究工具。然而，其分离培养难度大，纯度要求高，常成为实验瓶颈。

本文以小鼠脑血管周细胞为例，详细拆解了一套成熟、可靠的原代周细胞提取分离培养方案，助你突破细胞获取的**道难关

• 血管生成研究：支持周细胞与内皮细胞共培养，构建血管生成模型，研究血脑屏障与肿瘤血管新生。

• 组织工程：支持周细胞功能，用于3D生物打印与血管化组织构建。

• 神经退行性疾病：研究脑周细胞在阿尔兹海默病、帕金森中的作用。

1.组织获取

在无菌条件下取出小鼠脑部，置于预冷的DMEM中，小心去除脑膜，将脑灰质剪成约1mm大小的碎块。

2.酶消化、分离

将碎块转移至含有Ⅰ型胶原酶（1mg/mL）、300μLDNase Ⅰ（15μg/mL）和庆大霉素（50μg/mL）的DMEM离心管中，上下吹打均匀，37℃摇床消化1.5h；1000×g离心8min，弃上清；加入完全培养基充分重悬，1000×g离心5min，弃上清；用含胶原酶/分散酶（1mg/mL）和100μLDNase Ⅰ（15μg/mL）的DMEM重悬沉淀（主要为脑血管片段），37℃摇床消化1h；700×g离心6min，弃上清。

3.接种

DMEM重悬细胞沉淀后转移至33%连续Percoll密度梯度离心液中，4℃下1000×g离心10min。小心吸取上层微血管片段，用DMEM重悬2次。然后用含10% FBS的DMEM培养液将微血管片段接种至35mm培养皿中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。72h后换液以去除漂浮的死细胞以及其他杂质，之后每隔2d换液1次，自原代细胞从微血管片段爬出到细胞完全融合需培养12~14d。

4.传代培养

当细胞达90%汇合度时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1：2的比例进行传代，用于后续实验。

5.鉴定

海星生物（HySigen）通过α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光染色鉴定，结果应呈阳性；细胞纯度达90%以上；微生物检测应显示不含细菌、真菌等污染。

1.脑膜和血管上附着大量成纤维，如果剔除不干净，后续培养中成纤维细胞会疯狂生长。

2.全程低温：组织离体后必须立即浸泡在预冷的DMEM中，并在冰上操作，以降低细胞代谢。

3.消化时间作为参考，实际需要根据小鼠周龄和酶活性微调。

4.前72h内不要移动或晃动培养皿，影响细胞贴壁。

海星生物依托先进的技术平台，推出了多物种多组织来源的HyCyte^®原代周细胞产品。每一株细胞均经过免疫荧光和细胞纯度鉴定，同时确保无细菌、真菌等污染，品质经得起最严格的实验验证。

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