人肝癌细胞 (HepG2)

经非酒精性脂肪肝模型验证

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HepG2细胞是一种来源于人肝细胞癌（HCC）的细胞系，广泛应用于以下研究领域：药物代谢与毒性研究、肝癌生物学研究、代谢性疾病研究、外泌体与细胞间通信研究、生物活性物质筛选。本实验通过油酸（OA）和棕榈酸（PA）联合诱导HepG2细胞，模拟肝脏脂质沉积，用于研究非酒精性脂肪肝（NAFLD）或脂代谢紊乱机制。

| 实验原理

油酸（OA）是一种单不饱和脂肪酸，较易被细胞代谢并酯化为甘油三酯（TG），从而促进脂滴形成并诱导相对温和的脂质积累，常用于模拟单纯性脂肪变性。

棕榈酸（PA）作为一种饱和脂肪酸，更易诱发脂毒性，可导致内质网应激、氧化应激以及炎症反应（例如通过激活JNK和NF-κB信号通路），进而可能引起细胞凋亡或更严重的肝损伤。

将OA与PA联合使用（例如400 μM OA + 200 μM PA），可同时模拟脂质积累与脂毒性效应，广泛应用于构建NAFLD的复杂病理模型。

| 实验操作

1. 复苏细胞

(1) 准备一支15 mL离心管，在离心管中加入5 mL左右的预热好的HyCyte^®HepG2细胞专用培养基（TCH-G196）。

(2) 取出细胞，37℃水浴快速解冻后吸取细胞悬液至离心管中。

(3) 离心（1000 rpm, 5 min），弃上清，用HyCyte^®HepG2细胞专用培养基（TCH-G196）重悬，接种于对应的培养皿或培养瓶中。

(4) 置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，每2-3天传代（维持细胞密度在3×105~1×10⁶ cells/mL之间）。

2. 细胞培养与铺板

(1) 将HepG2细胞接种于6孔板，密度为1×10⁵ cells/孔，用HyCyte®HepG2细胞专用培养基培养至70%汇合度。

3. OA/PA-BSA复合物配制

(1) OA-BSA：溶解OA于无水乙醇配制成母液（100 mM母液，70℃加热并涡旋5min）。将母液逐滴加入8% BSA-PBS中，配制成终浓度为10 mM OA-BSA。60℃震荡1小时，过滤除菌，分装保存于-20℃。

举例：配制 10 mL 的 OA-BSA 溶液（10 mM OA-BSA），操作步骤：

a) 称取8 g BSA，溶于 100 mL PBS 中，制备 8% BSA-PBS 溶液。

b) 吸取/称量OA，加到无水乙醇中配制成100 mM OA 母液，溶解过程中需要70℃加热并涡旋5分钟。

c) 将1 mL 100 mM OA母液逐滴加入 9 mL 8% BSA-PBS 溶液中，配制成终浓度为10 mM OA-BSA溶液，溶解过程中需要60℃ 震荡 1 小时。

d) 过滤除菌，分装后保存于 -20℃。

(2) PA-BSA：溶解PA于无水乙醇配制成50 mM母液（70℃加热并涡旋5min）。将母液逐滴加入8% BSA-PBS中，配制成5 mM PA-BSA ，60℃震荡1小时，过滤除菌，分装保存于-20℃。

举例：配制 10 mL 的 PA-BSA 溶液（5mM PA-BSA），操作步骤：

a) 称量128.2 mg PA，加到10 mL无水乙醇中配制成50 mM PA 母液，溶解过程中需要70℃加热并涡旋5分钟。

b) 将1 mL 50 mM OA母液逐滴加入 9 mL 8% BSA-PBS 溶液中，配制成终浓度为5 mM PA-BSA溶液，溶解过程中需要60℃ 震荡 1 小时。

c) 过滤除菌，分装后保存于 -20℃。

4. 成脂诱导

(1) 诱导组：使用HyCyte®HepG2细胞专用培养基稀释OA/PA-BSA溶液配制成含OA/PA-BSA的诱导培养基（OA 400 μM + PA 200 μM）。举例：若配制10毫升诱导液，往10 mL完全培养基加入40 uL 10 mM OA-BSA和40 uL 的5mM PA-BSA，混匀后即可使用。

(2) 对照组：HyCyte®HepG2细胞专用培养基。

(3) 处理时间：72小时（每24小时换液）。

5. 脂滴检测（油红O染色）

(1) 吸走细胞培养器皿内的培养基，用1×PBS冲洗1~2次。

(2) 固定：4%多聚甲醛固定30分钟。

(3) 染色：新鲜油红O工作液的配制（现用现配）：取蒸馏水或1×PBS与油红O原液按比例（油红O原液: 1×PBS =3:2）混匀。对油红O工作液进行瞬时离心，以沉淀染色液中的过饱和析出物。也可选择用0.45μm滤膜/中性滤纸/纱布等进行过滤。室温染色15分钟。

洗涤：PBS洗3次，显微镜观察（红色脂滴为阳性）。

| 实验结果

检测与鉴定

油红O染色：诱导组脂滴面积占比＞30%（对照组＜5%）。

实验结果：油红O染色显示，诱导组（OA 400 μM + PA 200 μM）细胞质内出现大量红色脂滴（面积占比＞30%），显著高于对照组（＜5%）。该细胞适用于探究脂代谢相关基因/药物作用靶点。可作为NAFLD治疗药物的体外评价模型。

通过油酸（OA）和棕榈酸（PA）联合诱导 HepG2 细胞，模拟肝脏脂质沉积，用于研究非酒精性脂肪肝（NAFLD）或脂代谢紊乱机制。油红 O 染色显示，诱导组细胞质内出现大量红色脂滴显著高于对照组。该细胞适用于探究脂代谢相关基因/药物作用靶点，可作为 NAFLD 治疗药物的体外评价模型。

2. 培养操作便捷，适用范围广

3. 成本可控，性价比突出

采用德国纳米技术干冰桶运输，搭配详细实验手册与完整验证报告；细胞培养操作便捷，复苏活率＞80%，无需额外优化即可开展极化实验，大幅降低科研时间成本。

1. HepG2细胞的生长特点就是呈岛状生长，并且岛状生长的细胞扩张能力有限，长到一定大小之后就会堆积生长。

2. 要想细胞分散均匀，一方面是需要保证细胞消化过程中分散良好，另外一方面接种的初始密度不宜过低，否则就会有大面积的空白区域。

3. 另外如果实验需要HepG2为分散良好的单层细胞，可以用多聚赖氨酸包被培养瓶后培养，细胞将会呈单层分散的形式生长，但是形态跟不包被时差异比较大，会变成长梭形细胞。

4. HepG2细胞复苏或传代后会有少部分的细胞贴壁和部分悬浮的细胞，复苏两天后细胞会从贴壁细胞向外开始生长。在生长过程中，细胞会在贴壁细胞的上方生长，形成不同的细胞层。

5. 在细胞复苏的一周内，培养瓶中会有悬浮的活细胞团，在换液过程中不要丢弃这些活的悬浮细胞，可以通过离心（125×g）回收细胞，重新接种到培养瓶中，分离或者丢弃漂浮的活细胞会使细胞数量变少，引起细胞的停滞生长或细胞死亡。

6. 培养条件的细微变化，尤其是pH和培养基中血清的质量，可能会影响细胞的生长状况，在细胞的生长过程中会有细胞内的液泡出现，特别在细胞快要融合是会出现这种情况。培养细胞时使用未被灭活的高质量、低内毒素的胎牛血清，可以使细胞更好的贴壁和形成单层细胞。细胞在生长过程中可以通过将血清浓度提到到20%来改善细胞生长缓慢的情况。