VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术，以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域，在转座酶的催化下，将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构，并在基因组里面的固定序列位置进行插入，从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用，并充分体现出其：低成本、高效率、基因表达稳定的特点。

| 技术优势

1.序列完整性好，如果小环的结构被破坏则无法实现基因组插入；

2.可插入大片段，可以实现上百Kb的BAC片段的插入，而且能够保证其序列完整性，可以进行复杂的基因功能研究；

3.目的插入效率高，由于通过酶促反应，所以整个反应的过程效率远远高于DNA随机插入效率；

4.目的基因表达稳定，由于细胞插入的拷贝数相对于病毒来说比较稳定，在稳转株的构建过程中，细胞的表达更加稳定；

5.实验时间只需要慢病毒系统时间一半，实验更加安全；

6.可以实现：稳转之后对目的克隆进行检测后可以再将目的基因在原克隆移除，轻松实现加减法的对照。

| 技术流程图

| VIRUS-Free™ 细胞基因稳转技术

2Kb以内基因插入（合成法）

插入片段小于2Kb的项目，我们将通过化学合成的办法获得质粒，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

2-20Kb的基因插入（载体法）

插入片段2-8Kb的项目，我们将通过载体构建的办法来获得质粒，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

Step1. 目的序列PCR扩增

Step2. 目的载体的构建获得表达载体

Step3. 目的细胞的转导和抗性药物筛选获得目的克隆

BAC片段细胞系稳转（BAC修饰）

通过Red重组系统对BAC进行遗传修饰获得重组BAC，并进行细胞转导，通过抗药性的筛选获得稳转克隆。

Step1. 目的序列PCR扩增

Step2. 通过Red重组获得经过遗传修饰的BAC

Step3. 目的细胞的转导和抗性药物筛选获得目的克隆

| 案例分析

项目名称：构建由强力霉素(DOX)诱导的hKCNH2稳定过表达的人胚肾细胞HEK293

· 稳定细胞系的生成：将两种慢病毒载体同时转导至HEK293细胞中，以实现rtTA的持续表达以及hKCNH2基因的DOX诱导表达（图1）。

· 克隆分离：通过含药培养基筛选并富集稳定多克隆细胞，然后利用ClonePlus™技术进行单克隆分离。

· 诱导表达验证：通过qPCR分析证实了Dox依赖性诱导hKCNH2 mRNA表达（图2）。

图1. Tet-On hKCNH2表达系统的慢病毒载体图

图2. DOX依赖性地诱导 hKCNH2 mRNA 的表达

图3. DOX诱导的EGFP在单克隆HEK293细胞中的表达

| 参考文献

1. Li R, Zhuang Y, Han M, et al. piggyBac as a high-capacity transgenesis and gene-therapy vector in human cells and mice. Dis Model Mech 2013;6:828-33.

2. Hou X, Du Y, Deng Y, et al. (2015). Sleeping Beauty transposon system for genetic etiological research and gene therapy of cancers. Cancer Biol Ther 16:8–16

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